Основные группы АМП были созданы в 50-60-х годах прошло­го столетия, а в течение последующих 10-20 лет продолжалось их модифицирование [2]. Создание новых классов АМП позволяло надеяться, что мы всегда будем опережать патогены, и на рубеже веков такая самоуверенность казалась незыблемой. Однако поток новых АМП уменьшается, равно как и стремление фармацевти­ческих компаний их создавать. Затраты на разработку нового антимикробного препарата по разным оценкам уже превышают $ 800 млн.

На сегодняшний день принято считать, что основными причинами формирования резистентности патогенных бактерий является активное использование АМП в животноводстве и неоправданное их использование в клинической медицине [3]. В частности, проблемой является избыточное использование АМП при нетяжелых инфекциях, их нерациональное использование вследствие отсутствия доступа к квалифицированной медицинской помощи или нехватки у пациента денег для прохождения полного курса терапии [4].

В последние годы появляются работы, указывающие на то, что АР — это феномен намного более древний, чем антибиотикотерапия. АР скорее связана с общими механизмами устойчивости возбудителей к неблагоприятным факторам внешней среды, чем к определенным АМП.

Первые сообщения о выявлении резистентных к антибиотикам штаммов микроорганизмов проявились вскоре после открытия самих антибиотиков. Так, впервые резистентность к пенициллину была обнаружена в 1940 г., что предшествовало массовому использованию этих препаратов [5]. Резистентные штаммы золотистого стафилококка были обнаружены уже в 1948 г. [6]. Пенициллинрезистентный пневмококк впервые был идентифицирован в 1967 г. [7]. Резистентные к ванкомицину штаммы золотистого стафилококка выделяют с 1997 г.

Активное бесконтрольное применение АМП в животноводстве ведет к стремительному формированию АР у клинически значимых патогенов. Порядка 80% антимикробных препаратов, применяемых в животноводстве, идентичны используемым в медицине. Для повышения рентабельности антибиотики часто применяют у здоровых животных [2, 8, 9].

Нерациональное использование АМП в клинической медицине также является ведущим фактором формирования резистентности. По данным CDC (Centers for Disease Control and Prevention) США, до половины назначений АМП в амбулаторных условиях является необоснованным [6].

АР имеет выраженные региональные особенности. Так, к примеру, если доля устойчивых к пенициллину штаммов S. aureus, которые выделяют от пациентов с сепсисом, в США достигает 100%, то в Малайзии этот показатель намного меньше — порядка 70%. Доля ванкомицинрезистентных штаммов этого возбудителя в США с каждым годом увеличивается, тогда как в Малайзии до сих пор они зарегистрированы не были.

Ежегодные затраты на лечение состояний, вызванных антибиотикорезистентными организмами, в США составляет $ 4–7 млн. Лечение одного случая заболевания, обусловленного ванкомицинрезистентным штаммом S. аureus, обходится на $ 12 766 дороже, чем терапия аналогичного состояния, вызванного чувствительным микроорганизмом. Лечение пневмонии, обусловленной пенициллинрезистентным пневмококком, обходится в 3,5 раза дороже, чем терапия пневмонии, вызванной чувствительными к пенициллину штаммами возбудителя [1, 2, 10, 11].

Методы определения чувствительности бактерий к АМП

Учитывая, что основным источником наших представлений об АР являются лабораторные методы определения чувствительности бактерий к АМП, необходимо четко представлять их возможности и ограничения. На сегодняшний день существуют следующие методы определения чувствительности бактерий к АМП:

• диффузия в агар по Kirby – Bauer (метод дисков);
• серийные разведения;
• генетическая идентификация мутаций резистентности.

Метод диффузии в агар по Kirby – Bauer (метод дисков) наиболее распространен в микробиологических лабораториях всего мира. Он заключается в том, что после посева выделенного штамма микроорганизма на плотную питательную среду на нее же наносятся бумажные диски, содержащие определенную концентрацию АМП. В процессе диффузии препарата в агар создается концентрационный градиент. Активность АМП определяется величиной зоны отсутствия роста бактерий.

Разновидностью метода диффузии является так называемый Е-тест. Для Е-теста используются узкие полоски полимерного материала (0,5×6,0 см), на которые нанесен градиент концентраций АМП (от минимальных до максимальных). Эти полоски наносятся на среду аналогично дискам. Подавление роста микроорганизма вокруг полоски Е-теста происходит только в той зоне, где концентрация АМП, диффундирующего из носителя, выше минимальной подавляющей концентрации (МПК), при этом образуется каплевидная зона ингибиции. Значения концентрации АМП нанесены на каждом участке наружной поверхности Е-теста типографским методом. Величину МПК учитывают в том месте, где граница зоны подавления роста вплотную подходит к носителю.

Преимуществами метода диффузии являются его дешевизна и простота использования. В то же время этой методике свойственны недостатки, основным из которых является существенная зависимость создаваемого концентрационного градиента АМП от ряда условий. В частности, на него оказывает влияние плотность среды, которая, в свою очередь, зависит как от ее состава, так и от температуры культивирования. К тому же на результат определения чувствительности этим методом влияет рН среды и содержание в ней катионов (Ca2+, Mg2+). При оценке результатов следует учитывать, что диаметр зоны отсутствия роста измеряется в миллиметрах, поэтому необходима особая точность в проведении измерений. Также необходимо принимать во внимание то, что диаметр зоны отсутствия роста, соответствующий чувствительности/резистентности, является разным для каждого возбудителя и препарата.

Методика серийных разведений предполагает приготовление серии разведений антимикробного препарата в жидкой или плотной питательной среде. Полученные таким образом среды с АМП засеваются определенным объемом культуры исследуемого микроорганизма (инокулюмом). После инкубации оценивается наличие или отсутствие видимого роста. Таким образом можно определить МПК АМП в среде. Разновидностью метода серийных разведений является и метод, основанный на использовании только двух концентраций АМП, соответствующих пограничным значениям МПК. Эта методика часто используется в автоматизированных системах для определения чувствительности микроорганизмов.

Другой модификацией метода серийных разведений является микрометод, отличающийся от традиционного объемами жидкой питательной среды и инокулюма. Микрометод позволяет использовать стандартные 96-луночные планшеты с последующей оценкой наличия роста автоматизированными методами.

На сегодняшний день методика серийных разведений является золотым стандартом микробиологической диагностики АР. Основными ее недостатком являются высокая трудоемкость и стоимость.

Метод генетической идентификации мутаций резистентности позволяет непосредственно выявлять наличие у выделенных микроорганизмов генов, отвечающих за формирование устойчивости к антибактериальному препарату. Достоинством метода является его способность разграничить по генетическим механизмам различные ситуации, имеющие сходные фенотипические проявления. Недостатком — высокая стоимость, обусловленная необходимостью использования для идентификации каждой мутации отдельных тест-систем. Целесобразность метода заключается в его способности выявлять генетические маркеры резистентности у особо значимых в клинической практике патогенов (MRSA, VRE1).

Следует отметить, что все указанные методы дают возможность оценить устойчивость возбудителя к антибиотику in vitro. Но они не позволяют оценить эффекты, связанные с распределением и метаболизмом АМП в организме. Так, отсутствие клинической эффективности у чувствительного к данному АМП возбудителя может быть обусловлено недостаточной концентрацией АМП в очаге вследствие его плохого туда проникновения либо использования заниженных доз препарата. Однако отсутствие чувствительности микроорганизма к данному АМП in vitro не всегда свидетельствует о его клинической неэффективности. Это связано с тем, что в ходе метаболизма АМП in vivo могут образовываться метаболиты, обладающие выраженными противомикробными свойствами (примером может служить кларитромицин). Также вследствие кумуляции в очаге могут создаваться высокие концентрации, в которых АМП способен подавлять частично резистентных возбудителей (примером может служить цефоперазон, назначаемый при инфекциях желчевыводящих путей, аминогликозиды — при инфекциях почек, азитромицин — при различных инфекциях).

Возникновение и закрепление АР в популяции отражает естественное течение эволюционного процесса, составляющими которого являются наследственность, изменчивость и отбор.

Наследственность — совокупность природных свойств организма, передаваемых от поколения к поколению. Совокупность генов отдельного организма образует геном. Учитывая то, что отдельные представители одного вида могут различаться между собой, генофонд популяции можно рассматривать как совокупность генов всех организмов в популяции. Особенностью генетического аппарата бактерий является наличие кольцевой молекулы ДНК, в которой хранится основная генетическая информация организма (бактериальная хромосома). Также для бактерий характерно наличие плазмид — дополнительных кольцевых молекул ДНК, присутствие которых не является обязательным. В связи с этим можно выделить хромосомные и внехромосомные (плазмиды) факторы вирулентности. Чаще всего фактором переноса резистентности являются автономные, внехромосомные и, как правило, самопереносящиеся плазмиды.

Изменчивость — способность организма изменять свои свойства. Факторами, обуславливающими возможность изменчивости, являются мутации и рекомбинации. Мутации являются стохастическим (случайным) процессом, который может затрагивать любую область генома. Важной особенностью бактерий, которая отличает их от других организмов, является способность к конъюгации2, при которой происходит обмен полезными признаками в отсутствие истинного полового процесса.

Отбор. Наличие у индивидуума определенных признаков, повышающих резистентность к воздействию неблагоприятных факторов внешней среды, позволяет оставить большее количество потомков, которые вытесняют индивидуумов, их не имеющих. Таким образом, данный признак закрепляется в популяции. Чем выше скорость размножения организмов, тем быстрее произойдет вытеснение более приспособленными организмами их менее адаптированных собратьев. Время в популяционной генетике измеряется не в секундах, часах или годах, а в скорости появления новых генераций (поколений).

В зависимости от того, насколько устойчивость к АМП связана с определенными генами, проводят разграничение между АР и антибиотикотолерантностью (АТ) [12].

АР связана с наличием определенных генов, обеспечивающих реализацию того или иного физиологического механизма устойчивости к действию АМП. АР является видовым признаком и присуща всем представителям данного штамма возбудителя, вне зависимости от условий среды.

Термин АТ отражает наличие устойчивости к АМП на уровне популяции микроорганизмов. АТ не является генетически детерминированной на уровне генома отдельного организма, а отражает взаимодействие между отдельными клетками микробной популяции. Выжившие после воздействия АМП представители микробной популяции могут быть уничтожены данным АМП при изменении условий в самой популяции.

Существуют следующие механизмы АР:

• системы ограничения поступления/активного удаления АМП из цитоплазмы бактериальной клетки;
• изменение химической структуры АМП in vivo;
• изменение мишени для действия АМП.

Сама по себе стенка бактерий способна ограничивать поступление молекул малых размеров в цитоплазму клетки. Это свойство более выражено у грамотрицательных бактерий. Также существуют специальные насосные системы, активно удаляющие АМП из бактериальных клеток [13]. С существованием механизмов активного удаления препаратов из клетки связано формирование резистентности к фторхинолонам и тетрациклинам. У одного микроорганизма могут одновременно определяться несколько систем активного выведения препаратов. На сегодняшний день считается, что эволюционно эти системы возникли как механизмы, обеспечивающие резистентность к различным экзогенным химическим агентам [14].

Также у бактерий существуют разнообразные биохимические механизмы, изменяющие химическую структуру АМП in vivo. Пожалуй, наиболее известными из них являются β-лактамазы, разрушающие β-лактамное кольцо соответствующих антибиотиков [15]. Если ранее выявляемые ферменты из этой группы расщепляли только пенициллины, а не цефалоспорины, то в конце XX века появились сообщения о β-лактамазах, способных расщеплять как пенициллины, так и цефалоспорины. Эти ферменты получили название β-лактамазы расширенного спектра (БЛРС). Эффективными оказались попытки воздействия на микроорганизмы, формирующие резистентность подобным образом, посредством специфической блокады соответствующих ферментов — были синтезированы ингибиторы β-лактамаз, такие как клавулановая кислота и сульбактам. Однако длительное использование антибиотиков с упомянутыми ингибиторами β-лактамаз привело к формированию БЛРС, способных противостоять их воздействию [16]. Подобно β-лактамным антибиотикам, специфическими ферментами могут инактивироваться и другие АМП, в частности, хлорамфеникол может подвергаться ацетилированию. Аминогликозиды инактивируются путем ацетилирования их аминогрупп и фосфорилирования/аденилирования гидроксигрупп [17]. Резистентность к фторхинолонам появилась в последние годы, и одним из ее механизмов является ацетилирование. Интересно, что способность к ацетилированию фторхинолонов появилась вследствие мутации гена, отвечавшего за образование фермента ацетилировавшего аминогликозиды [18].

Формирование резистентности посредством изменения структуры мишени, на которую воздействует АМП, также распространено среди микроорганизмов. Мутации генов, кодирующих пенициллинсвязывающие белки, и, как следствие, изменение их структуры ведут к утрате чувствительности к пенициллинам [19]. Изменение структуры ДНК-гираз обуславливает резистентность к фторхинолонам [20]. Аналогичным образом изменение структуры мишени приводит к резистентности к рифампину, ванкомицину и линезолиду [21].

Механизмами, обуславливающими АТ и действующими на уровне всей популяции бактерий, являются [10]:

• персистенция;
• образование биопленок;
• скопление бактерий (многоклеточность).

Явление персистенции заключается в том, что в популяции бактерий, чувствительных к АМП, можно встретить медленно делящиеся или неделящиеся клетки. Благодаря низкой метаболической активности эти клетки устойчивы к действию АМП. Если перенести их в другие условия (пересеять), то эта устойчивость утрачивается [21].

Образование биопленок является сложным процессом, в ходе которого бактерии прикрепляются к твердому субстрату и образуют матрикс. Находящиеся в составе биопленок отдельные бактериальные клетки формируют сложно организованное сообщество, отдельные члены которого обмениваются между собой химическими сигналами. Показано, что бактерии в составе биопленок могут безопасно для себя переносить концентрации антибиотиков, губительно действующие на свободно живущие организмы. В то же время разрушение биопленки ведет к переходу бактерий в свободно живущие формы, чувствительные к обычным концентрациям АМП [23, 24].

Формирование резистентности в скоплениях бактерий (многоклеточность) напоминает образование биопленки, однако в отличие от нее встречается на поверхности полужидких сред [25]. После бинарного деления представители многих видов бактерий могут оставаться связанными между собой, пребывая в тесном контакте, при этом возможно обнаружить структуры, напоминающие плоты. Эти скопления мигрируют как единое целое. Подобно феномену биопленок, скопления бактерий также имеют повышенную резистентность к АМП. Их разрушение путем пересева на жидкие среды приводит к восстановлению чувствительности бактерий к АМП [26].

Борьба с биопленками представляет собой сложную и до сегодняшнего дня нерешенную задачу. Использование АМП, воздействующих не только на сами бактерии, но и на образуемый ими матрикс, рассматривается как один из механизмов повышения эффективности противомикробной терапии. Изучаются также возможности бактериофагов в этом плане.

Следствием многолетней борьбы с АР стало понимание того, что эпизодические разрозненные меры не могут замедлить процесс появления полирезистентных штаммов возбудителей и ограничить их распространение. Это понимание, в свою очередь, породило концепцию системы инфекционного контроля, под которой понимают комплекс мер, направленных на выявление случаев нозокомиальных инфекций, их этиологическую расшифровку, характеристику профиля АР и принятия на основе полученных данных определенных управленческих решений [27]. Согласно современным положениям, система инфекционного контроля должна функционировать на уровне каждого отделения поликлиники/стационара, каждого отдельно взятого государства и всего мира.

К сожалению, на сегодняшний день в Украине действует лишь один нормативный документ, посвященный системе инфекционного контроля — это приказ МЗ Украины № 234 от 10.05.2007 «Інструкція з організації та впровадження системи інфекційного контролю в акушерських стационарах», который вводит понятие системы инфекционного контроля, регламентирует клинический, микробиологический и эпидемиологический мониторинг за внутрибольничными инфекциями. Этот нормативный документ является достаточно прогрессивным, однако его воплощение на местах затруднено из-за недостаточного материального обеспечения, а узкоспециализированная направленность оставляет «вне игры» врачей других специальностей.

Идея скорейшего создания и внедрения системы инфекционного контроля во всех лечебных учреждениях Украины сегодня актуальна как никогда.

Литература

1. Рациональная антимикробная фармакотерапия: Руководство для практикующих врачей/В.П. Яковлев, С.В. Яковлев и др. – М.: Литерра, 2003. – 1008 с.
2. Smith RD, Yago M, Millar M, CoastJ. Assessing the macroeconomic impact of a healthcare problem: the application of computable general equilibrium analysis to antimicrobial resistance. Journal of Health Economics, 2005; 24: 1055–1075.
3. Barton MD (2000) Antibiotic use in animals feed and its impact on human health. Nut Res Rev, 13: 279–299.
4. Kiivet RA, Biba V, Enache D, Fottau V, Guilbinovic J, Oltvanyi N, Orazem A, Popova M, Stika L. Changes in the use of antibacterial drugs in the countries of Central and Eastern Europe. Eur J Clin Pharmacol 1995; 48: 299–304.
5. Abraham, E. P. and Chain, E. B., An enzyme from bacteria able to destroy penicillin. Nature, 1940, 46, 837.
6. Barber, M., Infection by penicillin resistant Staphylococci. Lancet, 1948, 2, 641–643.
7. Doern, G.V. et al., 2001. Antimicrobial resistance among clinical isolates of Streptococcus pneumoniae in the United States during 1999–2000, including a comparison of resistance rates since 1994–1995. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 45(6) 1721–1729.
8. Antibiotic Resistance: How Misuse of Antibiotics Could Threaten Your Health//FDA and you. – 2009. – № 16.
9. Wassenaar TM (2005) Use of antimicrobial agents in veterinary medicine and implications for human health. Critical Rev Microbiol 31: 155–169.
10. Cosgrove SE, Carmeli Y. The impact of Antimicrobial Resistance on Health and Economic outcomes. Clinical Infect Dis 2003; 36: 1433–1437.
11. Smith RD, Yago M, Millar M, Coast J. A macro-economic approach to evaluating policies to contain antimicrobial resistance:a case study of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA).Applied Health Economics and Health Policy, 2006; 5: 55–65.
12. R. Jayaraman Antibiotic resistance: an overview of mechanisms and a paradigm shift//CURRENT SCIENCE, VOL. 96, NO. 11, 10 JUNE 2009. P. 1475–1484.
13. 1Li, X. and Nikaido, H., Efflux-mediated drug resistance in bacteria. Drugs, 2004, 64, 159–204.
14. Piddock, L. J. V., Clinically relevant chromosomally encoded multidrug resistant efflux pumps in bacteria. Clin. Microbiol. Rev., 2006, 19, 382–402.
15. Bush, K., Jacoby, G. A. and Medeiros, A. A., A functional classification of beta -lactamases and its correlation with molecular structure. Antimicrob. Agents Chemother., 1995, 39, 1211–1233.
16. Canton, R. and Coque, T. M., The CTX-M beta-lactamase pandemic. Curr. Opin. Microbiol., 2006, 9, 466–475.
17. Azucena, E. and Mobashery, S., Aminoglycoside-modifying enzymes: mechanisms of catalytic processes and inhibition. Drug Res. Updates, 2001, 4, 106–117.
18. Robiscek, A. et al., Fluoroquinolone-modifying enzyme: a new adaptation of a common aminoglycoside acetyl transferase.Nature Med., 2006, 12, 83–88.
19. Zapun, A., Conters-Martel, C. and Vernet, T., Penicillin-binding proteins and -lactam resistance. FEMS Micribiol. Rev., 2008, 32, 361–385.
20. Ruiz, J., Mechanisms of resistance to quinolones: Target alteration, decrease accumulation and gyrase protection. J. Antimicrob. Chemother., 2003, 51, 1109–1117.
21. Courvalin, P., New, plasmid mediated resistance to antimicrobials. Arch. Microbiol., 2008, 189, 289–291.
22. Jayaraman, R., Bacterial persistence: some new insights into an old phenomenon. J. Biosci., 2008, 35, 795–805.
23. Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W. and Stoodley, P., Bacterial biofilms: from natural environments to infectious diseases. Nature Rev. Micribiol., 2004, 2, 95–108.
24. Lewis, K., Multidrug tolerance of biofilms and persister cells. Curr. Top. Microbiol. Immunol., 2008, 322, 107–132.
25. Lai, S., Tremblay, J. and Deziel, E., Swarming motility: a multicelluar behaviour conferring antimicrobial resistance. Environ. Micriobiol., 2009, 11, 126–136.
26. Kim, W., Killam, T., Sood, V. and Surette, M. G., Swam cell differentiation in Salmonella enterica serovar typhimurium results in elevated resistance to multiple antibiotics. J. Bacteriol., 2003, 185, 3111–3117.
27. Bennett & Brachman›s Hospital Infections, 5th Edition Copyright A©(C)2007 Lippincott Williams & Wilkins.