Відомо, що ВЕБ порушує механізми фізіологічного контролю клітинної проліферації — апоптозу. «Охороняючи» шфшоваш ним В-лімфоцити, вірус одночасно посилює апоптоз Т-лімфоцитів і нейтрофільних гранулоцитів, чим створює передумови для дов-готривалої персистенції віруса в В-клітинах, лімфопроліферації і, в деяких випадках, малігнізації лімфоїдної тканини внаслідок пору-шень механізмів Т-клітинного імунологічного контролю [2, 8, 9]. Інфікування організму людини ВЕБ викликає специфічну гуморальну і клітинну імунну відповідь. Ще одна властивість ВЕБ, як i інших repnecвipyciв — висока мутабельність, — дає змогу йому на невизначений термін уникати дії специфічних імуноглобулінів і клітин iмунної системи хазяїна. Таким чином, розмноження ВЕБ в організмі людини може слугувати причиною виникнення набутого імунодефіциту, ВІЛ-неасоційованого.

Відкриття біологічно активних речовин — цитокінів, які регулюють проліферацію і рівень функціональної активності клітин, дає змогу по-новому оцінити механізми формування запальних реакцій, зрозуміти імунні механізми формування системної запальної відповіді при даній хворобі, розробити нові методи прогнозування характеру інфекційної хвороби, обґрунтувати підходи до імунокорегуючої терапії з використанням препаратів, скерованих на саморегуляцію імунної системи [5, 10–12].

ВЕБ виробляє білки — аналоги інтерлейкінів (IL) та їх рецептори, які змінюють імунну відповідь, а саме: в період активного розмноження вірус продукує IL-10-подібний білок, який пригнічує Т-клітинний імунітет, функцію цитотоксичних лімфоцитів, макрофагів, порушуючи всі етапи функціювання натуральних кілерів (тобто важливих систем противірусного захисту) [8, 13–15].

У процесі хронізації цієї інфекції важливу роль відіграють імунні механізми. Більшість дослідників дійшли висновків, що переважання цитокінів, продукованих T-хелперами (Th) 2-го типу, асоціюється з вірусною персистенцією та хронізацією процесу при ВЕБ-інфекції, а Th 1-го типу — зі спонтанним видужанням та елімінацією збудника [14, 16, 17]. Вітчизняні дані щодо цитокінового профілю при хронічній ВЕБ-інфекції (ХВЕБІ) відсутні. Це викликає певний інтерес у проведенні досліджень і оцінки цитокінового статусу в підлітків і дорослих, хворих на ХВЕБІ.

Мета роботи

Метою роботи є оцінка стану імунної відповіді на підставі визначення вмісту Тh-1 (інтерферон альфа (α-ІФ) і IL-2) та Тh-2 (IL-4, IL-10) цитокінів у сироватці крові пацієнтів, хворих на ХВЕБІ, в стадії загострення та у віддалений період у дорослих і підлітків, та їх вплив на імунопатогенез і особливості перебігу хвороби.

Матеріали і методи дослідження

Ми спостерігали 60 хворих, які перебували на стаціонарному лікуванні у Львівській клінічній інфекційній лікарні протягом 2005–2007 рр., у яких вперше діагностовано хронічний перебіг ВЕБ-інфекції. Серед них було 33 підлітків (55%) і 27 дорослих (45%).

Діагноз ВЕБ-інфекції було встановлено за типовими клінічними симптомами й підтверджено даними серологічних і вірусологічних досліджень. За рекомендаціями С. Крамарєва [9] ХВЕБІ діагностували за наявністю у пацієнта протягом тривалого часу (більше 6 міс) клінічних симптомів, подібних до інфекційного мононуклеозу (ІМ). До додаткових діагностичних критеріїв ми відносили перенесене напередодні (у період до 6 міс перед обстеженням) гостре інфекційне захворювання, яке діагностовано чи встановлено ретроспективно, таке як інфекційний мононуклеоз, втягнення у патологічний процес низки органів і систем (лімфаденопатія, спленомегалія, персистуючий гепатит), позитивні результати полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), серологічних досліджень (при виявленні змін, які нетипові для гострого захворювання).

Методом імунофлюоресцентного аналізу (ІФА) з використанням діагностичних тест-систем фірми «Вектор-Бест» (Санкт-Петербург, Росія) виявляли антитіла до специфічних антигенів ВЕБ: anti-VCA IgM, anti-EA IgG, anti-EBNA IgG. Методом ПЛР проводили визначення ДНК ВЕБ у зскрібку зі слизової оболонки ротоглотки і в слині. Всім хворим проводили клінічні, лабораторні, бактеріологічні обстеження згідно з протоколом діагностики та лікування ІМ. При ураженнях печінки для диференціальної діагностики з вірусними гепатитами визначали в крові специфічні маркери гепатитів.

Рівень концентрації сироваткових цитокінів вивчали з використанням твердофазного імуноферментного методу із застосуванням пероксидази хріну як індикаторного ферменту за допомогою тест-систем «Протеїновий контур» (Санкт-Петербург, Росія). Вимірювання проводили за допомогою вертикального спектрофотометра. Кількісний вміст цитокінів у сироватці крові виражали в пг/мл. Для імунологічного дослідження в усіх хворих брали кров з вени на 1–2-й день потрапляння пацієнтів на стаціонарне лікування. Дослідження на цитокіни проведені у 43 (71,6%) пацієнтів з ХВЕБІ, серед них було 22 підлітки та 21 дорослий. Контрольну групу становили 10 здорових осіб (донори) віком від 18 до 27 років. Через 6 міс після виписки зі стаціонару обстежено 21 (35,0%) пацієнта, серед них 9 підлітків і 12 дорослих. Статистичний аналіз отриманих даних проводили за Ю.І. Івановим, 1990 [18].

Результати досліджень та їх обговорення

З анамнезу життя пацієнтів, хворих на ХВЕБІ, встановлено, що у більшості з них був несприятливий преморбідний фон: респіраторний алергоз (19,3%), довготривалий субфебрилітет (31,6%), хронічний трахеобронхіт (20,0%), хронічний гастрит, гепатохолецистит (3,5%). Захворювання на гострий інфекційний мононуклеоз в анамнезі було в 26 хворих (43,3%), у 6 випадках родичі хворіли на гострий ІМ протягом останнього року. Тригерними факторами, які призводили до розвитку імунних порушень, були часті (до 4–6 разів на рік) респіраторні інфекції (54,4%), кілька разів на рік перенесений гострий тонзиліт (40,4%), загострення хронічного тонзиліту (33,3%), лімфаденіт (8,3%), загострення аденоїдиту (26,3%). На підставі анамнезу у обстежених хворих можна діагностувати розвиток набутого імунодефіциту (D.84.8 за МКХ-101), що було підставою запідозрити ВЕБ-інфекцію у групи хворих, у яких клінічно не був верифікований гострий ІМ.

За результатами серологічних досліджень пацієнтів, хворих на ХВЕБІ, можна умовно розділити на три підгрупи в залежності від виявлених маркерів до вірусу ВЕБ (табл. 1).

У 1-у підгрупу увійшло 26 пацієнтів (43,3% — 12 підлітків і 14 дорослих), у яких методом ІФА виявлено антитіла до всіх антигенів віруса: anti-VCA IgM, anti-EA IgG, anti-EBNA IgG, що можна розцінити як реактивацію інфекційного процесу. У зскрібку і слині слизової оболонки ротоглотки ДНК ВЕБ виявлено у 82,3% осіб з цієї підгрупи.

До 2-ої підгрупи увійшло 18 пацієнтів (30,0% — 12 підлітків і 6 дорослих) з високими титрами антитіл до ядерного антигену anti-EBNА IgG і відсутністю anti-VCA IgM і anti-EA IgG, що, очевидно, відображає неповну ремісію захворювання. В усіх хворих цієї підгрупи виявлено ДНК ВЕБ.

До 3-ої підгрупи увійшло 16 осіб (26,7% — 7 підлітків і 9 дорослих) з високими титрами антитіл до капсидного і ядерного антигенів anti-VCA IgM і anti-EA IgG за відсутності anti-EBNA IgG — атипова реактивація. Позитивний результат ПЛР щодо виявлення ДНК ВЕБ слизової оболонки ротової порожнини отримано у 75% хворих з цієї підгрупи.

У клінічній картині 60 пацієнтів, хворих на ХВЕБІ, найчастіше зустрічався інтоксикаційний, лімфопроліферативний, кардіальний і артралгічний синдром. Частота і вираженість вказаних синдромів була неоднаковою в окремих групах пацієнтів. Нами проведений аналіз клінічних синдромів у хворих на ХВЕБІ в залежності від стадії хвороби (табл. 2).

У 1-й підгрупі підлітків (реактивація) імовірно частіше спостерігали гіпертрофію мигдаликів, гострий лакунарно-фібринозний тонзиліт та загострення хронічного тонзиліту, а також кардіальний синдром порівняно із дорослими, в той час як у дорослих можливо частіше виявляли артралгічний синдром. У 2-й підгрупі (неповна ремісія) у дорослих імовірно частіше спостерігали астеновегетативний, артралгічний синдром та хронічний тонзиліт порівняно з підлітками. У 3-й підгрупі (атипова реактивація) у дорослих статистично імовірно частіше спостерігали інтоксикаційний і артралгічний синдром, тоді як у підлітків — хронічний тонзиліт і кардіальний синдром.

Загострення хронічного тонзиліту і гіпертрофію мигдаликів II–III ст. виявлено у більшості пацієнтів усіх трьох підгруп. В усіх хворих спостерігали лімфопроліферативний синдром, який проявлявся гіпертрофією носоглоткових і піднебінних мигдаликів, генералізованою лімфаденопатією, яка характеризувалася збільшенням 7–9 груп лімфатичних вузлів у всіх обстежених. Максимальної гіпертрофії сягали підщелепові та передньо-задньошийні лімфовузли. Кардіальний синдром характеризувався болем в ділянці серця, дихальною аритмією, систолічним шумом над верхівкою, тахікардією, інколи брадикардією.

Збільшення розмірів печінки на 1–2 см і більше (по середньоключичній лінії) імовірно частіше спостерігали у дорослих (51,8%) порівняно з підлітками (24,2%, р<0,05). Також у дорослих спостерігали можливо вищу гіпербілірубінемію порівняно з підлітками (відповідно 29,6% і 6,1%, р<0,02). Спленомегалію спостерігали у 63,6% підлітків і 70,4% дорослих (р>0,05). Вірогідних відмінностей частоти підвищенної активності аланінової амінотрансферази у хворих на ХВЕБІ підлітків і дорослих не виявлено. Маркерів ВГ у жодного хворого не виявлено.

Рівні регуляторних цитокінів у сироватці крові пацієнтів, хворих на ХВЕБІ, мали свої особливості (рис.1, табл. 3). Слід зазначити, що в усіх хворих підвищення або зниження рівнів концентрації сироваткових цитокінів мали помірний характер відносно контрольної групи. При цьому найбільш інформативним показником серед цитокінів Th-1 виявився прозапальний цитокін α-ІФ, концентрація якого у період загострення була зменшена у пацієнтів всіх підгруп, як у підлітків, так і у дорослих, і дорівнювала в середньому відповідно 15,41±0,75 пг/мл і 15,35±0,90 пг/мл проти 21,14±2,63 пг/мл, що можливо (р<0,05) порівняно з даними контрольної групи.

Крім того, показники α-ІФ відрізнялися в різних підгрупах (рис. 2, табл. 3). Було зареєстровано зниження концентрації цього цитокіну у хворих 2-ї підгрупи (неповна ремісія), як у підлітків, так і у дорослих (відповідно 11,11±1,73 пг/мл та 11,50±2,27 пг/мл) порівняно з пацієнтами 1-ї та 3-ї підгруп (реактивація та атипова реактивація), що статистично імовірно (р<0,05).

Стосовно концентрації IL-2 також спостерігалася подібна тенденція. У хворих 2-ї підгрупи, які перебували в періоді клініко-біохімічної ремісії (неповна ремісія), як у підлітків, так і у дорослих спостерігали більш низькі концентрації IL-2 (14,40±1,10 пг/мл і 35,73±2,05 пг/мл) порівняно з відповідним рівнем IL-2 у хворих 1-ї та 3-ї підгруп (р<0,001 і р<0,05) та контрольної групи (48,53±4,89 пг/мл, р<0,001). Рівень сироваткового IL-2 в середньому дорівнював у підлітків 48,09±6,19пг/мл, у дорослих — 50,52±2,81 пг/мл, що не є статистично достовірним (р>0,05).

Відомо, що IL-2 відіграє головну роль в індукції клітинної ланки імунітету, адже саме він зі своїм рецептором слугує сигналом активації клітинного циклу і проліферації Т-клітин. Отже, знижені показники рівня цього цитокіну в сироватці крові, який є основним фактором росту Т-лімфоцитів, свідчать про недостатню повноцінність клітинної ланки імунної відповіді у пацієнтів на ХВЕБІ. Зменшення продукції а-ІФ та IL-2 вказує на депресію Th-1, що створює умови для персистенції ВЕБ, збереження віремії, низької здатності індукувати синтез інтерферону, внаслідок чого не забезпечується необхідний рівень противірусного захисту [9]. Зменшення вмісту IL-2 та α-ІФ супроводжувалося одночасним підвищенням вмісту таких протизапальних цитокінів, як IL-4 та IL-10, у хворих усіх груп (рис. 3, табл. 4).

Показники цих цитокінів статистично імовірно (р<0,001) підвищувалися як у підлітків (102,38±8,56 пг/мл і 136,72±16,20 пг/мл), так і у дорослих (99,38±5,92 пг/мл і 83,94±5,98 пг/мл) порівняно з контрольною групою (21,97±1,32 пг/мл і 35,49±2,68 пг/мл). Найбільш високі показники цих цитокінів спостерігали у хворих 1-ї та 3-ї груп, причому відмічалася імовірна різниця (р<0,05) щодо показників 2-ї підгрупи.

Ці цитокіни проявляють протизапальну дію, що, можливо, пов’язано з їх здатністю інгібувати функції Th-1 та пригнічувати продукцію α-ІФ. Високий вміст цих цитокінів у сироватці крові вказує на значний вплив Th-2-лімфоцитів і перевагу реакцій гуморального типу. Незбалансованість у системі цитокінового регуляторного ланцюга є ключовою ланкою імунопатологічних порушень при ХВЕБІ. У пацієнтів з ХВЕБІ у віддалений період (через 6 міс) було виявлено підвищення рівнів прозапальних (α-ІФ та IL-2) і зниження рівнів протизапальних (IL-4 і IL-10) цитокінів, але це відбувалося більш помірно порівняно з періодом загострення хвороби, хоча сироваткова концентрація досліджуваних цитокінів у пацієнтів статистично вірогідна (p<0,001) і перевищувала рівні контрольної групи. У підлітків концентрація сироваткового α-ІФ через 6 міс в середньому дорівнювала 51,78±3,84 пг/мл, у дорослих — 58,84±4,08 пг/мл, що імовірно порівняно з контрольною групою (p<0,001) (табл. 4). У пацієнтів (підлітки) 2-ї й 3-ї підгруп рівень сироваткового α-ІФ був дещо вищим (59,07±7,78 пг/мл і 56,95±3,15 пг/мл), що вірогідно (р<0,02) порівняно з 1-ю групою (43,73±4,15 пг/мл) і порівняно з відповідним рівнем α-ІФ у контрольній групі (р<0,001). У дорослих спостерігалося підвищення рівня α-ІФ у 1-й і 2-й підгрупах (відповідно 63,17±6,75 пг/мл і 60,37±11,64 пг/мл) і зниження у 3-й підгрупі (48,63±3,70 пг/мл), що вірогідно порівняно з відповідним рівнем α-ІФ у контрольній групі (р<0,001).

Концентрація IL-2 в середньому була вищою порівняно з такою у період загострення як у підлітків, так і у дорослих і дорівнювала відповідно 86,30±5,71 пг/мл і 101,51±5,55 пг/мл, що, можливо, вище порівняно з контрольною групою (р<0,001). Рівень концентрації IL-2 у пацієнтів 2-ї групи (неповна ремісія) як у підлітків, так і у дорослих був нижчим, ніж у пацієнтів 1-ї та 3-ї груп (р<0,01).

Рівень концентрації сироваткового IL-4 як у підлітків, так і у дорослих був дещо нижчим у 2-й групі (неповна ремісія), ніж у 1-й та 3-й, порівняно з відповідним рівнем IL-4 у контрольній групі (21,97±1,32 пг/мл, р<0,001). У середньому рівень концентрації сироваткового IL-4 у підлітків дорівнював 79,98±2,79 пг/мл, у дорослих — 79,94 ±3,81 пг/мл (р<0,001) (табл. 4). Навпаки, у дорослих в 2-й підгрупі спостерігали збільшення рівня сироваткового IL-10, а у підлітків зменшення порівняно з даними 1-ї й 3-ї підгруп та порівняно з відповідним рівнем контрольної групи (р<0,001) (табл. 5). У середньому вміст IL-10 дорівнював у підлітків 94,61±5,36 пг/мл, у дорослих — 83,50±7,08 пг/мл (р<0,001) (див. табл. 4).

Отримані дані показали, що умовою формування рецидивуючого перебігу ВЕБ-інфекції є неадекватна цитокінова відповідь у фазі її загострення, яка характеризується недостатньою активацією синтезу прозапальних цитокінів α-ІФ та IL-2, при посиленій секреції протизапальних цитокінівTh-2 IL-4 та IL-10. За нашими даними, хронізація процесу при ВЕБ-інфекції призводить до зменшення рівнів прозапальних і протизапальних цитокінів, хоча сироваткова концентрація досліджуваних цитокінів у пацієнтів на ХВЕБІ перевищувала відповідні рівні в контрольній групі. Відомо, що перебіг ВЕБ-інфекції залежить від стану імунної системи макроорганізму, при цьому противірусний імунітет значною мірою залежить від продукції цитокінів. Кінцевий результат біологічної дії цитокінів визначається їх кількісним вмістом, тимчасовою послідовністю синтезу різних цитокінів, взаємодією між собою. Дисбаланс у системі цитокінового регуляторного ланцюга є ключовою ланкою імунних порушень при ВЕБ-інфекції, а незбалансованість продукції цитокінів Th-1 і Th-2 відіграє важливу роль в імунопатогенезі хронізації та прогресуванні ВЕБ-інфекції.

Висновки

У період загострення ХВЕБІ спостерігають зниження рівнів α-ІФ та IL-2 як у дорослих, так і у підлітків, особливо в 2-й підгрупі (неповна ремісія), з одночасним наростанням рівнів сироваткових IL-4 та IL-10.

У віддалений період (6 міс) ХВЕБІ встановлено наростання рівнів сироваткових α-ІФ та IL-2 як у підлітків, так і у дорослих. Рівень IL-4 знижувався у дорослих і підлітків у віддаленний період значною мірою у 2-й підгрупі (неповна ремісія), а рівень IL-10 залишався високим у цій підгрупі.

Отримані дані показали, що умовою формування рецидивуючого перебігу ВЕБ-інфекції є неадекватна цитокінова відповідь у фазі загострення, яка характеризується недостатньою активацією синтезу прозапальних цитокінів α-ІФ та IL-2 при посиленій секреції протизапальних цитокінів Th-2 IL-4 та IL-10.

Література

1. Кельцев В.А., Петрова Е.В., Санталова Г.В. Состояние иммунной системы у детей с инфекционным мононуклеозом и обоснование иммуннокорегирующей терапии//Детские инфекции. – 2004. – № 3.– С. 15–20.
2. Hirao M., Harabuchi Y. Analysis of EBV-specific cellular cytotoxicity in tonsillar lymphocytes//J. Otorhinolaringol Society of Japan. – 1994. – T. 97, № 3 – P. 473–484.
3. Larochelle B., Flamand L., Gourde P. EBV infects and induces apoptosis in human neutrophils//Blood. – 1998. – T. 92, № 1. – P. 291–299.
4. Клиническое значение иммунологических маркеров ВЭБ-инфекции при инфекционном мононуклеозе у детей//Куртасова Л.М., Ольховський И.А., Якунина Е.Ю. и др.//Клиническая лабораторная диагностика. – 2005. – № 12. – С. 44–46.
5. Straus S., Cohen J. Ebstein-Barr virus infections: biology, pathogenesis and management//Ann Inter Med. – 1992. – № 118. – Р.45–58.
6. Cozad J. Infectious mononucleosis//Nurse Pract. – 1996. – T. 44, № 7. – Р. 659–664.
7. Kuender D., Yang H., Harry R. Hill Immune responses to infectious diseases: an evolutionary perspective//Pediatr Infect Dis J. – 1996. – 15, № 4. – Р. 355–364.
8. Nakamura H., Nakamura K., Yodoi J. Redox regulation of cellular activation//Annu Rev Immunol. – 1997. – № 15. – Р. 351–369.
9. Крамарєв C.O., Виговська O.В. Інфекція, спричинена вірусом Епштейна–Барр: клінічні варіанти, діагностика, принципи терапії//Мистецтво лікування. – 2005.– № 10.–С. 64 – 69.
10. Jeffrey I.Cohen. Epstein-Barr virus and immune system//Jama, 1997.–Vol. 278, № 6.– P. 510–514.
11. Симбирцев А.С. Цитокины — новая система регуляции защитных реакций организма//Цитокины и воспаление. – 2002. – Т. 1, № 1. – С. 9–17.
12. Uchida J. Epstein-Barr virus—proteins of lytic cycles//J Exp Med.1988. – Vol.186. – P. 436–438.
13. Van der Horst, Joncas J et al. Lack of effect of peroral acyclovir for the treatment of acute infectious mononucleosis//J Infect Dis, 1991. – Vol. 164. – P. 788–792.
14. Дранник Г.Н. Клиническая иммунология и алергологія. — М.: Медицинское информационное агентство, 2003. – 604 с.
15. Regulation by endogenous IL-10 of the expression of NO-synthase induced after ligation of CD 23 in human monocytes/N. Dugas, M. Palacios-Calender, Dugas B. et al.//Cytokines. – 1998. – № 10. – Р. 680–689.
16. Maia D.M., Peace-Brewer A.L. Chronic active Epstein-Barr virus іnfection//Curr Opin Hematol. – 2000. – 7, № 1. – Р. 59–63.
17. Stephen E.S. The chronic mononucleosis syndrome//J. Infectious Dis. – 1988. – 157: 3.
18. Иванов Ю.И., Погорелюк О.Н.//Обработка медико-биологических исследований. – М.: Медицина, 1990. – 217 с.