Одним из основных принципов работы современной лабо­ратории является автоматизация лабораторного процесса. Практикуемый еще сегодня во многих клинико-диагностических лабораториях ручной (мануальный) метод анализа базируется на непосредственном участии лаборанта в осуществлении всех основных этапов клинико-лабораторного исследования: взятии биологического материала, реагентов, их смешивании, инкуба­ции, регистрации аналитического сигнала, расчете концентрации определяемого вещества. При этом даже незначительные откло­нения в условиях выполнения анализа (неизбежно возникающие при постановке большого количества проб) могут существенно повлиять на конечный результат лабораторного исследования. Стандартизация, достигаемая автоматизацией всей процедуры анализа, повышает надежность выполнения анализа, сокращает время на проведение тестирования, расход реагентов и объем биологического материала.

Автоматизация лабораторных исследований в мировой практике началась приблизительно с середины 50-х годов прошлого столетия. Первым толчком к ее внедрению послужило создание фотометров и спектрофотометров с контролируемой температурой кюветы, что позволило реализовать на практике принцип кинетического исследования субстратов, ферментов и других веществ. В дальнейшем в этих аппаратах появилась электронная функция автоматического перевода регистрируемых значений в показатели концентрации или активности.

Преимуществами современных автоматизированных анализаторов являются интеграция нескольких методов анализа, возможность проведения множества анализов из одной пробирки с использованием минимального объема образца, гарантия высокой точности исследования, автоматизированный контроль качества и многое другое.

Общий анализ крови

Общий анализ крови является одним из наиболее часто назначаемых лабораторных анализов в практике врача-клинициста. Результаты этого анализа дают общие представления о состоянии организма и в ряде случаев являются основанием для дальнейшего углубленного обследования пациента.

По данным анализа крови определяют содержание гемоглобина в крови, скорость оседания эритроцитов (СОЭ), проводят количественный и качественный состав клеток крови.

При определении содержания гемоглобина чаще всего анализируют производные гемоглобина, образовавшиеся в процессе его окисления и присоединения к гему различных химических групп, приводящих к изменению валентности железа и окраски раствора.

К устаревшим методам определения гемоглобина, все еще применяемым в ряде лабораторий, можно отнести сапониновый метод и метод Сали. При использовании сапонинового метода тельца Гейнца не растворяются, раствор остается мутноватым, вследствие чего может меняться спектр поглощения раствора. В методе Сали определяют концентрацию гематина, образовавшегося при взаимодействии гемоглобина с соляной кислотой. Содержание гемоглобина оценивают визуально путем сравнения окраски исследуемого образца со стандартным раствором. На результаты исследования влияет очень много факторов: содержание белков крови, количество билирубина в крови, характер освещения и др. Точность этих методов недостаточна, ошибка может достигать 30%.

В настоящее время широкое распространение получили колориметрические методы определения содержания гемоглобина с помощью приборов. Для количественного определения содержания гемоглобина с помощью колориметрического метода необходимо превратить все производные гемоглобина, содержащиеся в крови человека, в одну форму. Лучшими методами для этого являются гемиглобинцианидный и гемихромный, обеспечивающие надежность и высокую точность количественного определения содержания гемоглобина в крови.

СОЭ является одним из наиболее часто определяемых лабораторных показателей. Под СОЭ понимают скорость разделения вертикально стоящего столбика несвернувшейся крови на два слоя: верхний, состоящий из прозрачной плазмы, и нижний, состоящий из осевших эритроцитов. Международным комитетом по стандартизации в гематологии рекомендован метод Вестергрена. Результаты, получаемые с помощью метода Вестергрена и распространенного в нашей стране метода Панченкова, совпадают в области нормальных значений, однако метод Вестергрена более чувствителен к повышению СОЭ.

К ручным (мануальным) методам анализа клеточного состава крови относится подсчет и определение морфологических характеристик клеток крови под микроскопом. Классический микроскопический метод — использование камеры Горяева. Главным принципом этого метода является подсчет эритроцитов под микроскопом в определенном количестве квадратов счетной сетки с последующим пересчетом на 1 мкл крови. Основными недостатками ручного метода являются очень высокая трудоемкость, субъективность и недостаточная надежность исследования. Малейшие отклонения от правил (при взятии крови в пипетку, перемешивании содержимого пробирки перед заполнением камеры, подготовке камеры, подсчете меньшего, чем требуется по методике, количества клеток и др.) значительно влияют на качество и точность результата. Такие объективные факторы, как длительность исследования, напряжение и усталость глаз лаборанта, недостаточное количество лаборантов в штате, ограничивают число проводимых исследований в лаборатории.

Использование гематологических анализаторов значительно повышает надежность исследования и производительность лаборатории. В современных анализаторах для подсчета количества клеток и определения морфологических характеристик используют импедансный метод (Культера) и проточную цитофлуориметрию. Импедансный метод применяют для подсчета количества и определения размера частиц. В его основе лежит измерение электрического сопротивления, возникающего при прохождении клеток крови через апертуру малого диаметра. Применение принципа проточной цитофлоуметрии в гематологии дает возможность определять степень дифференцировки и гетерогенность клеточной популяции. В основе этого метода лежит способность света возбуждать молекулы флуоресцентных красителей.

По количеству измеряемых параметров и степени дифференциации лейкоцитов гематологические анализаторы можно разделить на три поколения:

Приборы 1-го поколения начали внедрять в лаборатории с 80-х годов прошлого столетия. Это были полуавтоматические приборы, которые на сегодняшний день уже сняты с производства. В анализаторах для подсчета клеток был использован импедансный метод. Анализаторы 3-го поколения превосходят по своим характеристикам приборы 2-го поколения. Импедансный метод в них дополнен методом лазерной цитофлуориметрии, а в некоторых приборах — и цитохимией для выявления дополнительных параметров. Кроме того, приборы могут дополняться и другими измерительными каналами, например, для определения уровня С-реактивного протеина (СРП) (турбодиметрия).

В современных анализаторах автоматизирован процесс подачи пробирок, при этом используются стандартные вакуумные пробирки. Некоторые анализаторы могут работать с такими пробирками без открытия крышки. Еще одно преимущество специально предназначенных для гематологического анализатора пробирок — наличие в них уже готового концентрата антикоагулянта (обычно ЭДТА), что позволяет избежать ошибок преаналитического этапа. Наличие в анализаторе программы контроля качества и ежедневное его выполнение гарантируют точность работы прибора. Существует возможность просмотра на экране результатов контроля качества в графической и табличной форме и хранения их в памяти анализатора длительное время.

Таким образом, объединение импендансного метода с проточной цитофлуориметрией в современных гематологических анализаторах позволяет проводить наряду с определением стандартного общеклинического анализа крови полную дифференциацию лейкоцитов, идентификацию анормальных типов клеток и анализ моноклональных антител. Возможность проанализировать большее количество клеток в одном образце обеспечивает высокую точность и достоверность результатов в сравнении с простым микрокопированием.

Использование гематологических анализаторов последнего поколения позволяет освободить персонал лаборатории от трудоемкого ручного подсчета клеток, увеличить количество измеряемых параметров крови, стандартизировать процесс измерения клеток крови и увеличить его точность, повысить производительность и эффективность работы лаборатории.

Биохимические исследования

При помощи биохимических методов определяют активность ферментов и концентрацию субстратов. Аналитические наборы для клинической химии основаны на различных аналитических принципах измерения.

Традиционными являются методы конечной точки, основанные на образовании окрашенных продуктов реакции. Примерами традиционных методов конечной точки являются определение уровня холестерина методом Илька, глюкозы — ортотолуидиновым методом, трансаминаз — методом Райтмана — Френкеля и др. К недостаткам этого метода относят большую длительность времени реакции (от 10 до 40 мин), недостаточную точность определения биохимических параметров, невозможность проведения мероприятий по контролю качества исследований. Контрольные сыворотки, которые используют для проведения межлабораторного и внутрилабораторного контроля качества, как правило, не аттестованы по данным методикам.

Кинетический метод является более чувствительным, чем метод конечной точки, и позволяет раньше выявить патологические изменения. При использовании этого метода параметры определяют за 2–5 мин. На анализаторах регистрация происходит в автоматическом режиме, активность ферментов оценивают без калибровки. При использовании этого метода можно легко выявить возможные погрешности на аналитической стадии. В наборах реагентов для кинетических исследований, как правило, используют более чистые реактивы. Существует много аттестованных по этим методам контрольных сывороток, позволяющих контролировать качество исследований с использованием любой системы.

Нефелометрия основана на феномене рассеивания света, когда падающий луч ударяется в частицу или комплекс антиген — антитело в растворе. В результате этого количество рассеянного света пропорционально количеству антигена. Нефелометрию типично используют для определения уровня специфических белков, которые, связываясь с антителами, образуют крестообразные частицы в растворе. Под нефелометры обычно специализированы отдельные анализаторы, имеющие ограниченное меню тестов, поскольку принцип рассеивания света применим только для молекул размером не больше 40 нм. Несмотря на это, в современных автоматических коагулометрах нефелометрический метод успешно сочетают с иммунотурбидиметрическим и клоттинговыми методами.

Турбидиметрическая методика схожа с нефелометрией и основана на взаимосвязи проходящего луча света и частицы, такой, как иммунный комплекс. Количество света, проходящего через раствор, уменьшается в зависимости от мутности раствора. Основная концепция та же, что и в абсорбционной спектрофотометрии: количество проходящего через раствор света уменьшается с повышением концентрации частиц. Поэтому с помощью анализатора для клинической химии можно проводить как традиционные спектрофотометрические, так и иммунотурбидиметрические исследования. Как и при нефелометрии, с помощью турбидиметрии определяют содержание специфических белков.

Преимуществом иммунотурбидиметрии над нефелометрией является возможность проведения редкостных тестов на классических высокопроизводительных биохимических анализаторах с использованием одной пробирки.

В рутинной лабораторной практике для определения основных параметров клинической биохимии чаще всего используют спектрофотометрические способы определения. Среди применяемых с этой целью анализаторов можно выделить три группы:

1. Спектрофотометры.
2. Полуавтоматические биохимические анализаторы.
3. Полностью автоматизированные аналитические системы.

Спектрофотометры рассчитаны на регистрацию величины оптической плотности и производят элементарные математические операции с полученными величинами. Подготовку реагентов, смешивание и внесение образцов, распределение очередности тестов для всех этих анализаторов осуществляет врач-лаборант вручную, поэтому используемые при этом методики называют ручными, или мануальными.

Полуавтоматические анализаторы также требуют вмешательства оператора. Врач-лаборант готовит пробы и смешивает реагенты. Стадии автоматизированы с момента введения реакционной смеси в анализатор.

Применение ручных и полуавтоматических методик значительно повышает вариабельность результата анализа за счет весомого влияния человеческого фактора, неконтролируемых условий подготовки реакционной смеси, а в ручных методиках — и течения самой реакции.

Полностью автоматизированные биохимические анализаторы осуществляют дозирование реагентов, их смешивание и внос реакционной смеси в зону анализатора автоматически. Контроль оператора необходим только на стадии программирования тестов и установлении регламента последовательности определения тех или иных параметров и количества анализируемых проб.

Все биохимические автоанализаторы оснащены современным программным обеспечением, в них использована современная компьютерная техника, осуществляется контроль за работой отдельных блоков прибора и качества проводимых лабораторных исследований (в соответствии с заложенной компьютерной программой), автоматизированы пробоподготовка и дозирование [2].

Точность определения биохимических маркеров во многом зависит и от используемых реактивов. Наиболее удобными для использования являются жидкие, полностью готовые к применению диагностические наборы. Для этих реактивов характерны повышенная стабильность и длительный срок хранения. Отсутствие стадии разведения (что необходимо для лиофилизированных реактивов) полностью исключает ошибки, связанные с использованием некачественной воды и погрешностями посуды, а также влиянием человеческого фактора. Благодаря использованию таких реактивов достигаются высокая точность и чувствительность методов.

Одним из достаточно информативных лабораторных тестов, широко используемых в настоящее время, является электрофорез белков биологических жидкостей (сыворотка крови, моча, спинномозговая жидкость и др.), который позволяет получить значительный объем диагностической информации. Принцип электрофоретического разделения молекул состоит в их движении с различной скоростью в постоянном электрическом поле. В клинической практике чаще всего используют электрофорез на поддерживающих средах-носителях — хроматографической бумаге, ацетатцеллюлозных мембранах, различных гелях, а также на комбинированных средах.

Электрофорез на бумаге до недавнего времени широко применяли во многих лабораториях. Основными недостатками метода являются длительность (2–3 дня) и недостаточная точность исследований.

Электрофорез в агарозном, крахмальном и особенно в полиакриламидном геле дает существенно лучшие результаты, позволяя идентифицировать большее количество белковых фракций сыворотки (до 30). Однако сложность приготовления геля и дороговизна готовых гелевых пластин ограничивают использование данного метода.

Применение мембран из целлюлозы ацетата позволяет повысить четкость фракционирования и значительно сократить время, необходимое для разделения, окраски и анализа [1].

Одним из самых современных и перспективных сепарационных методов на сегодняшний день является капиллярный электрофорез, вобравший в себя все лучшие качества хроматографических методов и электрофореза. [5]. Капиллярный электрофорез обеспечивает очень высокую эффективность разделения, поэтому метод широко применяют не только для выявления сходных по строению веществ (белков, пептидов, аминокислот, витаминов, наркотиков, красителей, ионов токсичных металлов, анионов), но и для идентификации лекарственных препаратов, при проведении клинических анализов, в криминалистике и судебной экспертизе. Метод характеризуется не только превосходной разрешающей способностью, но и быстротой выполнения [3].

Уникальные системы полностью автоматического клинического капиллярного электрофореза дают возможность определять белковые фракции, специфические белки, иммуноглобулины, а также проводить скрининг наличия моноклональных компонентов в сыворотке крове и моче без участия лаборанта.

Иммунохимические исследования

Современные лабораторные анализаторы являются интегрированными системами, которые включают и иммунологические методы исследования. Иммунологические исследования приобретают все больший удельный вес в обследовании пациентов. Без результатов иммунологического обследования невозможно установить диагнозы большинства эндокринных заболеваний, вирусных гепатитов, системных коллагенозов и др. Инфекционная иммунология является отдельным разделом лабораторной диагностики, позволяющей идентифицировать вирусные, бактериальные, паразитарные инфекции, определить титры антител, оценить иммунитет к отдельным видам инфекционных заболеваний и пр.

Развитие практических иммунологических методов началось в 60-годах прошлого столетия с началом внедрения радиоиммунных методик (RIA1), которые характеризуются высокой чувствительностью и селективностью. В RIA радиоактивный изотоп используется в качестве метки, а уровень измеренной радиоактивности является индикатором количества аналита. [4]. Это положило начало проведению интенсивных исследований и последующему широкому применению радиоиммуноанализа в лабораторной практике. RIA используют и сегодня, особенно для определения очень малых количеств аналита. Однако очевидны и его недостатки и прежде всего — радиоактивность и проблема захоронения отходов. Кроме того, в RIA усложнена стандартизация, так как срок годности наборов зависит от периода полураспада радиоактивного йода-125. Это объясняет развитие широкого спектра альтернативных методов, не требующих применения радиоактивных изотопов и использующих различные физические принципы количественного определения метки.

В частности, на смену RIA пришел другой тип иммунологических исследований, который называется иммуноферментным анализом (EIA2). В EIA вместо радиоактивной используют ферментные метки. Типичными ферментными метками являются щелочная фосфатаза, пероксидаза хрена и β-галактозидаза. В то время как в RIA радиоактивность используется для определения концентрации аналита, в EIA применяются изменение цвета, эмиссия света или другой сигнал.

Твердофазный иммуноферментный анализ представляет популярную форму иммуноанализа, объединяющего реагент, антитела (антиген) с ферментативной меткой и твердофазносвязанными антителами (антигеном). Изначально в качестве твердофазного материала использовали либо микротитровочные планшеты, либо микрочастицы. Микротитровочные планшеты — это квадратный пластиковый планшет с неглубокими лунками, которые покрыты реагентом.

Начиная с конца 70-х и в 80–90-х годах прошлого столетия началось активное внедрение автоматизации и повышения чувствительности иммуноферментных методов. Несколько лет в этой области доминировали метод флуоресцентного поляризационного иммуноанализа и ферментативный анализ на микрочастицах. Позже начали рутинно применять хемилюминесцентный магнетический анализ благодаря присущей ему высокой аналитической чувствительности.

При проведении флуоресцентно-поляризационнго иммуноанализа (FPIA3) антиген метят флуоресцентной меткой, которая конкурирует с немеченым антигеном из образца. Сравнительно медленная ротация больших молекул, а также способность частиц, которые медленно двигаются, поляризировать свет применяются для определения количества больших частиц антитело — антиген — флуоресцеин в растворе. При этом принципе измерения концентрация аналита непрямо пропорциональна уровню измеряемого сигнала. Флуоресцентно-поляризационный иммуноанализ используют для проведения точного и чувствительного измерения для таких малых токсикологических аналитов, как лекарственные препараты, наркотики, токсические вещества и некоторые гормоны.

При ферментативном анализе на микрочастицах (MEIA4) твердофазные микрочастицы покрыты антителами против интересующего антигена и используются для связывания аналита. Антитело для детекции метят ферментом, как и в EIA. Концентрация аналита пропорциональна уровню измеренного сигнала. Неконкурентный принцип сандвича дает результаты, которые прямо пропорциональны количеству аналита.

Хемилюминесцентный магнетический иммуноанализ (CMIA5): хемилюминесцентные компоненты тоже можно использовать в качестве метки аналитов. Они отличаются от радиоактивной, флуоресцентной и ферментативной метки. Хемилюминесцентная метка продуцирует свет, когда связывается с триггерным реагентом. Этот метод очень похож на MEIA, но в CMIA чувствительность выше и процедура промера проще. Большое количество анализаторов в клинической лабораторной диагностике основаны на хемилюминесцентной технологии, отличается в основном тип метки, который часто запатентован, поэтому анализ также может проводить по-разному. С помощью различных подвидов иммуноанализа определяют широкий спектр таких аналитов, как гормоны, маркеры кардиоваскулярной патологии, онкологические маркеры.

На сегодня существуют полностью роботизированные интегрированные системы, позволяющие проводить биохимические и иммунохимические исследования на одной универсальной платформе. Одновременно можно исследовать до 367 образцов. За 1 ч определяют до 1200 биохимических и до 200 иммунологических показателей. Запатентованные технологии (хемилюминесцентная акридиновая метка, система промывки) позволяют достичь высокой точности исследований.

Таким образом, одними из основных факторов, определяющих качество исследования, являются:

1. Применяемый аналитический метод.

2. Используемые реактивы.

3. Наличие автоматизированных анализаторов.

4. Наличие внутрилабораторной и внешней систем контроля качества.

На сегодня в арсенале лабораторной диагностики существует достаточно широкий спектр методик и технологий для замены старых ручных методов. Учитывая, что результат лабораторного обследования и своевременная информация очень важны для врача-клинициста, современные лаборатории в состоянии предложить практическому врачу достаточно мощные инструменты для ежедневной работы.

Литература

1. Гильманов А.Ж., Саляхова Р.М. Электрофорез сывороточных белков: современные возможности анализа. http://med.com.ua
2. Камышников В.С. Справочник по клинико-биохимическим исследованиям и лабораторной диагностике. – М.: МЕДпресс-информ, 2004.
3. Рудаков О.Б., Селеменев В.Ф. Физико-химические системы сорбат-сорбент-элюэнт в жидкосной хроматографии. — Воронеж, 2003. – 240 с.
4. Хемилюминесценция как наиболее чувствительный метод иммуноанализа. www.medservis.az
5. Perrett D. Capillary electrophoresis in clinical chemistry // Ann. Clin. Biochem.1999; 36: 133–150.